Label-free, real-time detection platform of Hepatitis B Virus antigens with protein biosensors

HEPATVIRDETECT

Abstract:

Chronic Hepatitis B virus (HBV) is the cause for severe liver pathologies leading to ~ 1 million deaths per year, and Romania has among the highest incidence among EU countries. Screening and early clinic diagnosis are extremely relevant to prevent further viral spreading. Importantly, early productive infection can be evidenced by measuring the titers of the secretory HBV proteins, the “surface” (HBs) or “early” (HBe) antigens (Ag). The HBsAg is the first serological antigen detectable in serum ~ one week after HBV infection, followed by HBeAg, which becomes evident during viral replication. This proposal aims to place innovation at the heart of discovery, and develop a portable, label-free, first-generation protein-based nanosensor, for the sensitive and selective detection of HBeAg, by exploiting its interaction with the specific anti-HBe antibody. At the core of the endeavor lies an innovative sensing paradigm, according to which analytes of interest are identified as they disrupt the ionic current passing through a single nanopore. Knowing that nanopore technology evolved into a mature, single-molecule screening technology and revolutionized single-molecule detection, as done in Europe by Oxford Nanopore Technologies (https://nanoporetech.com), our platform will pave the way to developing nearly ideal sensors for HVB detection, for integration in low-cost, low-powered, portable, and wearable devices. Our project will start at technological readiness level, as we have preliminary data demonstrating the feasibility of the protein nanopore-based technology for the uni-molecular detection of analytes. Subsequently, we aim to harness our findings and bring them to the next level (TRL3), in which we will demonstrate and validate the ‘proof-of-concept’ of an integrated, portable device enabling the detection of HBeAg in a variety of real-world biological samples.

Selected Objectives:

Objective 1: Single-molecule study of the interactions between HBeAg and its antibody, anti-HBeAg, with the α-HL nanopore.

Objective 2: Proof-of-concept of real-time fingerprinting of HBeAg, through single-molecule stochastic sensing of the HBeAg/anti-HBeAg dimer with the α-HL nanopore.

Objective 3: Development of portable and stable, α-HL nanopore-based platform, for point-of-care HBeAg detection, superior to existing technologies in terms of throughput, affinity and selectivity.

Results and dissemination

Scientific articles/ Articole științifice

  • Non-Receptor-Mediated Lipid Membrane Permeabilization by the SARS-CoV-2 Spike Protein S1 Subunit – Asandei, A.; Mereuta, L.; Schiopu, I.; Park, J.; Seo, C-H.; Park, Y.; Luchian, T., ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES, 2020, 12(50), 55649- 55658
  • The Nanopore-Tweezing-Based, Targeted Detection of Nucleobases on Short Functionalized Peptide Nucleic Acid Sequences – Dragomir, I.S., Asandei, A., Schiopu, I, Bucataru, I.C., Mereuta, L., Luchian, T., POLYMERS 2021, 13 (8), 1210
  • Single-molecule, hybridization-based strategies for short nucleic acids detection and recognition with nanopores – Luchian, T.; Mereuta, L.; Park, Y.; Asandei, A.; Schiopu, I., PROTEOMICS 2021, e2100046, DOI10.1002/pmic.202100046
  • Single-Molecule Detection And Manipulation With Biological Nanopores – Schiopu I., Asandei A., Mereuta L., Dragomir I.S., Bucataru I.C., Luchian T., Studia Chemia 2021.
  • Teaching an old dog new tricks: a lipid membrane-based electric immunosensor for real-time probing of the spike S1 protein subunit from SARS-CoV-2 – Asandei A., Mereuta L., Schiopu I., Park Y., Luchian T., PROTEOMICS 2021.
  • A single-molecule insight into the ionic strength dependent, cationic peptide nucleic acids – oligonucleotides interactions – Asandei Alina, Loredana Mereuta, Bucataru Ioana C. Park Yoonkyung, Luchian Tudor, Chemistry: An Asian Journal 2022, Acceptat, DOI 10.1002/asia.202200261.
  • A programmable nanopore sensor for multiplexed detection of short polynucleotides based on length-variable, poly-arginine-conjugated peptide nucleic acids – Loredana Mereuta, Asandei Alina, Dragomir Isabela, Park Jonggwan, Park Yoonkyung, Luchian Tudor, Analytical Chemistry – În Evaluare

Scientific report/ Rapoarte științifice

National patent application/Depunere cerere brevet națională – Cerere nr A/00172 din data 4.04.2022

Final Results/ Rezultate finale (popularizarea rezultatelor)

Virusul Hepatic B (VHB) rămâne o problemă majoră de sănătate publică, cauzând moartea a peste 800.000 de pacienți în fiecare an, la nivel global. Se estimează că aproximativ 3,5% din populația lumii este infectată cronic cu VHB, peste 40% dezvoltând boli hepatice severe, precum ciroza hepatică și cancer hepatocelular. Eradicarea hepatitei virale sau cel puțin limitarea drastică a acestor infecții presupune creșterea semnificativă a capacității de diagnostic (majoritatea acestor infecții rămân azi nedepistate), îmbunătățirea accesului la tratament și mărită acoperirea vaccinală, în special în zonele endemice. Găsirea unor metode de detecție sensibile, reproductibile, ușor de manipulat fără să necesite personal medical de înaltă calificare, aplicabile la scară largă ar avea ca rezultat creșterea numărului de pacienți diagnosticați.

În acest context, ne-am propus să dezvoltăm un nanosenzor proteic portabil util pentru detecția senzitivă și selectivă a HBeAg prin intermediul interacțiunilor selective dintre antigenii HBV și anticorpi anti-HBe. Pentru aceasta am utilizat atât HBeAg pur (comercial) cât și cel rezultat din infecția cu VHB. Abordarea experimentală are la bază analiza interacțiunilor dintre nanoporul proteic și complexul format dintre antigenul HBeAg și anticorpul specific anti-HBeAg care pot fi cuantificate prin intermediul evenimentelor distincte de blocare a curentului ionic mediat de nanopor în condițiile aplicării unui câmp electric transmembranar optim (monitorizarea modificărilor de amplitudine și durată a evenimentelor de blocare a curentului ionic mediat de nanopor).

În cadrul acestui proiect, am reușit producerea cu succes a HBeAg în sistem procariot, ca proteină solubilă, funcțională, aceasta fiind un rezultat în premieră care deschide calea pentru stabilirea unei platforme rentabile de producție a acestui antigen la costuri reduse. După obținerea antigenului HBeAg (in house) s-a studiat la nivel de singură moleculă interacțiunile dintre HBeAg și anticorpul acestuia, anti-HBeAg, cu ajutorul nanoporului de αHL.

În vederea distingerii amprentei specifice a moleculelor de HBeAg, Ab(HBe) și a complexului antigen-anticorp HBeAg – Ab(HBe), pentru dezvoltarea platformei portabile și stabile s-a elaborat un protocol experimental bazat pe următoarele raționamente de bază:

  • (i) analiza și înțelegerea mecanismului molecular de capturare a moleculelor de HBeAg și Ab(HBe) de către nanopor;
  • (ii) optimizarea parametrilor și condițiilor care favorizează interacțiunea complexului molecular HBeAg/anti-HBeAg cu nanoporul de α-HL;
  • (iii) creșterea sensibilității de detecție prin manipularea parametrilor de concentrație molară;
  • (iv) scăderea raportului zgomot/semnal în vederea creșterii stabilității și sensibilității metodei.

În urma experimentelor realizate, deși sunt necesare optimizări suplimentare pentru a crește debitul, specificitatea recunoașterii moleculare într-un mediu biologic complex și sensibilitatea sistemului de nanopori pentru a-l apropia de un dispozitiv accesibil, robust, sofisticat, fără instrumente, care să permită screening-ul serologic precis, considerăm că principiul funcționării unui astfel de sistem în laborator (TLR3) a fost demonstrat.


TEAM:

  1. Project Coordinator: Alexandru Ioan Cuza University of Iasi
  • Project leader:  Prof. Dr. Tudor LUCHIAN
  • Team member: CS II Dr.  Alina ASANDEI
  • Team member: Conf. Dr. Loredana MEREUȚĂ
  • Team member: CS III Dr. Irina ȘCHIOPU
  1. Partner institution: The Institute of Biochemistry-IB, Bucharest
  • Team leader: CS I Dr. Norica NICHITA
  • Team member: CS II Dr. Cătălin LAZĂR
  • Team member: PhD student

Finance by: Ministry of Ntional Education, P2 – Increasing the competitiveness of the Romanian economy through RDI (https://uefiscdi.gov.ro)

PED: Demonstration experimental project

Contract: 365PED/2020

COD: PN-III-P2-2.1-PED- 2019-0016

Project Coordinator: Alexandru Ioan Cuza University of Iasi

Partner institution:The Institute of Biochemistry-IB, Bucharest

Implementation period: 01.11.2020 – 30.04.2022

Project Manager: Prof. dr. LUCHIAN Tudor, Alexandru Ioan Cuza University of Iasi


Contact: luchian@uaic.ro